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唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)檢驗方法GB4789.29-2020



錄入時間:2020-10-28 11:39:11 來源:青島海博生物

1 范圍

本標準規定了食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)[Burkholderia gladioli( Pseudomonas cocovenenans subsp. farino f ermentans>]的檢驗方法。

本標準適用于食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)的檢驗。

2 設備和材料

2.1 實驗室常規滅菌設備。

2.2 冰箱:2℃~8 ℃、—20℃~—30℃。

2.3 恒溫培養箱:26 ℃士l ℃,36 ℃士l ℃。

2.4 恒溫水浴鍋:46℃士l℃。

2.5 顯微鏡:10倍~100倍。

2.6 均質器。

2.7 離心機:3000 r/min。

2.8 電子天平:感量0.l g。

2.9 比濁計。

2.10 錐形瓶:容量100 mI,500 ml.。

2.11 無菌培養皿:直徑90 mm、直徑150 mm。

2.12 無菌透明玻璃紙﹑濾紙。

2.13 無菌灌胃器: l ml。

2.14 微生物生化鑒定系統。

2.15 小鼠:18 g~20 g,每一批次試驗應使用同一品系的KM或ICR小鼠。

3 培養基和試劑

3.1 GVC增菌液。

3.2 改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂(mPDA)。

3.3 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)。

3.4 PCFA培養基。

3.5 馬鈴薯葡萄糖半固體瓊脂。

3.6 卵黃瓊脂。

3.7 革蘭氏染色液。

3.8 氧化酶試劑。

3.9 Hugh-Leifson培養基(O/F試驗用)。

3.10 蛋白胨水(靛基質試驗用)。

3.11 緩沖葡萄糖蛋白胨水(MR和V-P試驗用)。

3.12 西蒙氏檸檬酸鹽培養基。

3.13 苯丙氨酸培養基。

3.14 糖發酵管。

3.15 半固體瓊脂。

3.16 抗O多價血清、型特異性因子血清(O-Ⅲ,O-Ⅳ,O-Ⅴ,O-Ⅵ,O-Ⅶ,O-Ⅷ)。

3.17 生化鑒定試劑盒。

4 檢驗程序

唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)檢驗程序見圖1。

5 操作步驟

5.1 樣品處理

無菌操作稱取25 g(mL)樣品,置入盛有225 mL GVC增菌液的無菌均質袋中(鮮銀耳樣品取1g,用剪刀剪碎,加入盛有20 mL.GVC增菌液的無菌均質袋中),用拍擊式均質器拍打1 min~2 min;或置入盛有225 mL GVC增菌液的無菌均質杯中,以8000 r/min~10000 r/min均質1 min~2 min;若樣品為液態,振蕩混勻。

5.2 增菌

將上述樣品增菌液置36℃士1℃培養20 h~24 h。

5.3 分離

用直徑3 mm的接種環取增菌液一環,分別劃線接種于mPDA平板和PCFA平板,36 ℃士1℃培養24 h~48 h。觀察各個平板上生長的菌落,各個平板上菌落特征見表1。

5.4 初篩試驗

自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個以上典型或可疑菌落(低于5個全選),分區劃線接種于卵黃瓊脂平板﹐36 ℃士l℃培養。挑取培養18 h~24 h的菌落進行革蘭氏染色及氧化酶試驗。對于革蘭氏染色陰性、氧化酶試驗陰性的菌繼續培養至48 h士2 h,對于卵磷脂酶陽性,帶有虹彩環的單個菌落,接種PDA平板,36 ℃士1 ℃培養24 h士2 h。

5.5 生化試驗

從純培養的PDA平板上挑取菌苔進行生化鑒定。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)生化特征見表2?蛇x擇生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統。

5.6 血清學分型(可選擇項)

5.6.1 菌體抗原的制備

將PDA平板36 ℃士1℃培養24 h士2 h的培養物用無菌生理鹽水洗下﹐沸水浴(100 ℃)2 h,3000 r/min 10 min離心棄上清液﹐再用無菌生理鹽水稀釋至5×108CFU/ml~1×109CFU/ml菌懸液﹐作為凝集試驗用抗原。

5.6.2 菌體抗原的鑒定

用多價血清做玻片凝集試驗,同時用生理鹽水做對照。與多價血清凝集者,依次用O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-V、O-Ⅵ、O-Ⅶ、O-Ⅷ因子血清做試管凝集試驗。根據試驗結果,判定菌體抗原型。在生理鹽水中自凝者不能分型。生化特征符合,但不能與以上血清凝集者,需保留菌株做進一步鑒定。

5.7 毒性試驗

5.7.1 產毒培養

將初步鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)的菌株接種PDA平板,36℃士1℃,培養24 h士2 h,用滅菌接種環刮取適量菌苔,加到3 mL無菌生理鹽水的試管中,配成1麥氏濃度(McFarland,MCF)的菌懸液(約為108CFU/mL.),用無菌吸管吸取0.5 mL,滴在鋪好無菌玻璃紙的直徑150 mm馬鈴薯葡萄糖半固體平板上,用無菌L棒涂布均勻,26 ℃士1℃培養5 d。取下帶菌的玻璃紙,將半固體平板置于100 ℃流動蒸汽滅菌30 min。室溫冷卻后,置一20 ℃~-30℃冰箱過夜。將冰凍好的半固體平板置室溫融化,用無菌吸管吸出凍融液﹐經濾紙過濾至無菌試管或錐形瓶中(此為毒素粗提液),4℃避光保存。

同時,將未接種菌苔、鋪好無菌玻璃紙的直徑150 mm馬鈴薯葡萄糖半固體平板作為陰性對照﹐按照同樣的試驗方法制備陰性對照粗提液﹐4℃避光保存。

5.7.2 毒力測定

取毒素粗提液或經100 ℃水浴蒸發后的5倍~10倍濃縮液﹐灌胃小鼠3只,每只0.5 mL,觀察至7 d。若菌株產生米酵菌酸﹐小鼠在灌胃后20 min~24 h內發病。主要癥狀為豎毛、萎糜不振、躁動,繼而行步蹣跚、肢體麻痹、癱軟﹑抽搐,呈角弓反張狀,呼吸急促、死亡。

取陰性對照粗提液或經100 ℃水浴蒸發后的5倍~10倍濃縮液,灌胃小鼠3只,每只0.5 ml.,觀察至7 d。小鼠應健康存活。

5.7.3 米酵菌酸測定

毒力測定實驗陽性時,分別取毒素粗提液,陰性對照粗提液,按照GB 5009.189執行。

6 結果報告

生化試驗符合且毒性試驗陽性,報告檢出唐莒蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種);生化試驗和毒性試驗有一項不符合,報告未檢出唐莒蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)。

附:GB4789.29-2020唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)檢驗 點擊下載

附:GB4789.29唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)檢驗用培養基核算表 點擊下載

GB4789.29  唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)檢驗

用途

貨號

名稱

規格

稱量數

需求

每瓶/盒/包可做配制

單價

增菌

HB8591

GVC增菌液

250g

26g/L

225ml/樣

每瓶可配42個樣

120

分離

HB9153

改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂(mPDA)

250g

46g 每升

每個平板20ml

每瓶約300個平板

180

HB9140

PCFA培養基

250g

 

 

 

280

HB9140a

PCFA培養基添加劑

1ml*5支

每200ML加入一支   每250g需要配8包

80

初篩

待定

卵黃瓊脂培養基基礎

250g

48g 每升

每個平板20ml

每瓶約260個平板

140

HB8295

50%卵黃乳液

5ml*10支

 

10支

 

65

HB2100

氧化酶試紙

10片

 

 

可以使用10次

25

HB8278

革蘭氏染色液

5ml*8

 

 

可以使用30次

40

純化

HB0233

馬鈴薯葡萄糖瓊脂

250g

46g 每升

每個平板20ml

每瓶約300個平板

160

產毒培養

HB0233-2

馬鈴薯葡萄糖半固體瓊脂

250g

31g每升

 

 

120

生化鑒定

GB049

OF生化管

20支

 

35

GB117

葡萄糖

20支

 

 

 

30

GB144-1

果糖

20支

 

 

 

35

GB032

木糖

20支

 

 

 

40

GB152

半乳糖

20支

 

 

 

35

GB163

阿拉伯糖

20支

 

 

 

30

GB169

蔗糖

20支

 

 

 

25

GB107

核糖醇(側金盞花醇)

20支

 

 

 

40

GB007

甘露醇

20支

 

 

 

30

GB105

肌醇

20支

 

 

 

35

 

衛茅醇

20支

 

 

 

30

GB008

半固體瓊脂

20支

 

 

 

30

GS004

尿素

20支

 

 

 

30

GB066

明膠生化管

20支

 

 

 

40

GB033

硝酸鹽還原

20支

需配套硝酸鹽還原試劑盒

30

GS011

西蒙氏枸櫞酸鹽

20支

 

 

 

30

GB113

L-精氨酸雙水解酶

20支

 

 

 

35

SN043

氨基酸脫羧酶對照

20支

 

 

 

30

HB8801

石蕊牛奶培養基

250g

101.67g每升

每管5-10ml

 

130

GS001

蛋白胨水

20支

需滴加靛基質試劑盒

30

GS003

MR-VP生化管

20支

需要配套甲基紅試劑盒、V-P試劑盒

30

GB095

苯丙氨酸脫氨酶

20支

需滴加如下指示劑

30

GB095a

苯丙氨酸指示劑

5ml*4

 

 

 

30

GB065

硫化氫

20支

 

 

 

30

 

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