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植物乳桿菌檢驗標準操作程序



錄入時間:2021-5-11 10:31:56 來源:青島海博生物

標準依據:《GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測》


1 設備和材料


除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下。

1.1 恒溫厭氧培養箱:37±1℃。

1.2 冰箱:2-5℃。

1.3 天平:感量為0.1g。

1.4 均質器及無菌均質袋、均質杯。

1.5 振蕩器。

1.6 無菌吸管:1 mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。

1.7 無菌錐形瓶:容量250mL、500mL。

1.8 無菌培養皿:直徑90mm。

1.9 顯微鏡:10倍~100倍 。

1.10 pH計或pH比色管或精密pH試紙。


2 培養基和試劑


2.1 MRS( Man Rogosa Sharpe) 瓊脂培養基。

2.2 MRS肉湯培養基。

2.3 無菌生理鹽水。

2.4 革蘭氏染色液。

2.5 細菌生化鑒定試劑盒。


3 檢驗程序


植物乳桿菌檢驗程序見圖1。

圖1 植物乳桿菌檢驗程序


4 操作步驟


4.1 樣品制備

4.1.1 固體和半固體樣品

稱取25g樣品,置于225mL生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min-2min制成1:10的樣品勻液;或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質杯中,8000r/min-lO000r/min均質1min~2min制成1:10的樣品勻液。

4.1.2 液體樣品

應先將其充分搖勻后,以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)中,充分振搖,制成1:10的樣品勻液。


4.2 樣品稀釋

4.2.1 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于裝于9mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻,制成1:100的樣品勻液。

4.2.2 另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭,按上述操作順序,做10倍遞增樣品勻液,每遞增稀釋一次,即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。


4.3 培養

根據對待檢樣品菌含量的估計,選擇2個~3個連續的適宜稀釋度,每個稀釋度吸取樣品勻液0.1mL接種于MRS瓊脂平板內,使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面,涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個稀釋度接種2個平板。涂布后,將平板靜置10min使接種物完全被培養基吸收。翻轉平皿置于37℃±1℃厭氧培養箱中培養48h±2h。


4.4 菌落計數

4.4.1 選取特征菌落數在30CFU~300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于30CFU的平板記錄具體菌落數,大于300CFU的可記錄為多不可計。 每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。

4.4.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數;若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻。即可計算半個平板后乘以2,代表一個平板菌落數。

4.4.3 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時,則將每條單鏈作為一個菌落計數。


4.5 鑒定

4.5.1 菌落挑選和純培養

挑選平板上5個邊緣透明、整齊的菌落分別轉入MRS肉湯培養基37±1℃厭氧培養箱中培養24h±2h后進行形態學、生化鑒定。

4.5.2 形態學鑒定

革蘭氏染色、鏡檢。植物乳桿菌為革蘭氏陽性桿菌,呈直桿狀,長度3.0μm~8.0μm,單個、成對或成鏈狀,通常缺少鞭毛,無芽孢。

4.5.3 生化鑒定

使用細菌生化鑒定試劑盒進行生化鑒定。鑒定特征見附B.1。乳桿菌屬常見菌種主要鑒別特征參見表C.1。


5 結果計算


5.1 每個平板中植物乳桿菌的數量

每個平板中植物乳桿菌菌落數的計算見式(1) :


  a=b/A×C               ...............(1)


  式中:

  a—每塊平板上的植物乳桿菌菌落數;

  b—挑取后經證實為植物乳桿菌的菌落數;

  A—挑取平板上用于驗證的菌落數;

  C—平板上的所有特征菌落數。


5.2 菌落總數的計算方法

5.2.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內,計算兩個平板中植物乳桿菌菌落數的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每克(毫升)中菌落總數結果。

5.2.2 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時,按式(2)計算:


  N=∑C/(n1+0.1n2)×d       ...............(2)


  式中:

  N—樣品中菌落數;

  C—平板(含適宜范圍菌落數的平板)菌落數之和;

  n1—第一稀釋度(低稀釋倍數)平板個數;

  n2—第二稀釋度(高稀釋倍數)平板個數;

  d—稀釋因子(第一稀釋度)。


6 報告


6.1 結果判定

若樣品菌落符合植物乳桿菌形態學及生化鑒定的特征,可判定為植物乳桿菌。


6.2 結果報告

6.2.1 定性報告

在25g(mL)樣品中檢出或未檢出植物乳桿菌。

6.2.2 定量報告

菌落數小于100CFU時,以整數報告。菌落數大于或等于100CFU時,對第3位數字進行修約后,取前2位數字,后面用0代替位數; 也可用10的指數形式來表示,采用兩位有效數字。

  本文節選自《GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測》。

附:

GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測  點擊下載

GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測標準用到的培養基  點擊下載

 

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